PEWARNAAN GRAM

Laporan praktikum mikrobiologi ke : 5

Hari, Tanggal : Jumat, 29 September 2017

PEWARNAAN GRAM

Trisda Sela Mutiara

4443150022

Perikanan 3B

Kelompok 1

JURUSAN PERIKANAN

FAKULTAS PERTANIAN

UNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASA

2017

ABSTRAK

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan maka dari itu diperlukannya pewarnaan gram agar dapat menyimpulkan termasuk golongan mana bakteri tersebut didalam pewarnaan gram membagi manjadi 2 kelompok yaitu bakteri gram positif yang menghasilkan warna ungu atau biru gelap dan bakteri gram negative yang terlihat dengan menghasilkan warna merah muda, adapun tujuan dalam praktikum ini mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur tersebut dan pelaksanaan praktikum tersebut pada tanggal 29 september 2017 di laboratorium THP jurusan perikanan dan setelah melakukan uji coba yang mendapatkan hasil bakteri gram negatif pada preparat yang diambil.

Kata Kunci      : Bakteri, Gram, Positif, Negatif, dan Warna

PENDAHULUAN

            Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan Salah satu cara untuk melihat dan mengamati bentuk sel bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, sehingga untuk diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan atau pewarnaan sel bakteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah di amati, hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri ini melalui serangkaian pengecatan, oleh karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang  paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi.

            Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna dapat mengadsobsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur seperti spora,flagella dan bahan inklusi yang mengandung zat pati dan granula fosfat (Entjang 2003). Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya. Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain Kristal violet, iodide, metylen blue, karbol, fuchsin, safranin (Lay 1994). Proses pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan dan hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum (Dwidjoseputro 1998).

            Bakteri gram positif dalah bakteri yang dapat mempertahankan zat warna metal ungu suatu proses pewarnaan gram bakteri jenis ini berwarna biru atau ungu dibawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah muda. Perbedaan dua jenis bakteri ini didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya 2010).

            Bakteri gram negative memiliki 3 lapisan dinding sel, lapisan terluar yaitu lipid kemungkinan tercuci oleh alcohol, sehingga pada saat pewarnaan dengan safranin akan berwarna merah, bakteri gram positif memiliki dinding sel berupa peptidoglican yang tebal setelah pewarnaan dengan Kristal violet, pori-pori menyempit akibat dekolorisasi oleh alcohol sehingga dinding sel tetap menahan warna ungu (Fitria 2009).

            Praktikum ini bertujuan mengenal dan mempelajari prosedur pewarnaan gram dan memahami pentingnya setiap langkah dalam prosedur tersebut dengan pengamatan bakteri pada biakkan koloni yang telah dikultur.

TINJAUAN PUSTAKA

             Mikrobiologi adalah ilmu yang mempelajari makhluk-makhluk hidup yang kecil, yang hanya dapat dilihat dengan mikroskop (mikros = kecil, bios = hidup, dan logos= ilmu). Makhluk hidup yang kecil ini disebut mikroba atau mikro-organisme. Bakteri berasal dari kata latin bacterium  (jamak, bacteria) , adalah kelompok raksasa dari organisme hidup. Mereka sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniseluler (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa nucleus (inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitoondria dan kloroplas. Istilah  “bakteria” telah diterapkan untuk semua prokariota atau kelompok besar mereka, tergantung pada gagasan mengenai hubungan mereka. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Mereka tersebar (tersebar dimana-mana) di tanah, air, dan sebagai simbiosis dari organisme lain. Banyak pathogen merupakan bakteri.

             Meski umumnya memiliki dinding, seperti sel tumbuhan dan jamur, tertapi dengan komposisi yang sanngat berbeda (peptidoglikan). Banyak yang bergerak menggunakan flagella, yang berbeda dalam strukturnya dari flagella kelompok lain. Bakteri pertama ditemukan oleh Anthony van Leewenhoek pada tahun 1674. Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak berwarna dan kontras dengan air, dimanas el-sel bakteri tersebut di suspensikan,. salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi ialah degan metode pengecatan atau pewarnaan. Hal tersebut juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi dinding sel bakteri melalui serangakaian pengecatan (Entjang 2003).

Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih. Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm Bakteri merupakan organisme prokariot. Umumnya ukuran bakteri sangat kecil,  bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo 2004). Sel bakteri memiliki panjang yang beragam, sel beberapa spesies dapat berukuran 100 kali lebih panjang daripada sel spesies yang lain. Bakteri merupakan makhluk hidup dengan ukuran antara 0,1 sampai 0,3 µm. Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung.

Mikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro 1994).

Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram positif dan gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka (Volk & Wheeler 1993).

Pewarnaan terhadap bakteri yang paling sering dilakukan adalah pewarnaan Gram dan Ziehl‐Nelsen. Pewarnaan tersebut untuk mengetahui morfologi, struktur, dan karakteristik bakteri. Pewarnaan Gram dapat mengidentifikasi penyakit infeksi. Prosedur pewarnaan Gram dimulai dengan pemberian kristal violet, setelah itu ditambahkan larutan iodium maka semua bakteri akan berwarna biru. Setelah itu ditambah alkohol. Bakteri Gram positif membentuk kompleks Kristal iodine yang berwarna biru. Setelah di tambahkan safranin, bakteri Gram positif akan berwarna ungu. Contoh bakteri Gram positif adalah Streptococcus, Bacillus, Stapilococcus, Clostridia, Corynebacterium dhypteriae, Peptococcus, Peptostreptococcus, dll. Sedangkan bakteri Gram negatif akan terdekolorisasi oleh alcohol dan pemberian safranin akan memberikan warna merah pada bakteri Gram negatif. Contoh bakteri Gram negative adalah Neisseria, Klebesiella, Vellonella, Shigella, Salmonella, Hemophillus, dll (Cappuccino & Sherman 1983).

Pewarnaan bakteri bertujuan untuk memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras mikroorganisme dengan sekitarnya. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial (Pelczar & Chan 2007).

Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif  pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan menunjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas dinding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada bakteri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram positif diperlakukan dengan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet (Razali 1987).

Prinsip dasar dari pewarnaan adalah adanya ikatan ion antara komponen selular dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarna yang disebut kromogen. Ikatan ion dapat terjadi karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarna. Terdapat tiga mcam metode pewarnaan yaitu pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial dan pewarnaan gram. Pewarnaan sederhana menggunakan pewarna tunggal, pewarnaan diferensial memakai serangkaian larutan pewarna atau reagen. Pewarnaan gram merupakan metode pewarnaan yang paling umum digunakan untuk mewarnai sel bakteri (Suriawiria 1999).

     Teori Salton menjelaskan bahwa ada konsentrasi lipid yang tinggi pada dinding sel bakteri Gram negatif. Sehingga jika lipid dilarutkan dalam pemberian alcohol, maka pori‐pori akan membesar dan tidak mengikat pewarna. Hal ini menyebabkan bakteri menjadi tidak berwarna. Sedangkan bakteri Gram positif akan mengalami denaturasi selama pemberian alcohol. Hal ini akan mengecilkan pori‐pori sehingga menghasilkan kompleks kristal iodium. Bakteri Gram positif memiliki dinding sel yang kuat dan lapisan peptidoglikan sebanyak 30 lapisan sehingga permeabilitas dinding selnya menjadi berkurang. Sedangkan bakteri Gram negatif hanya memiliki satu sampai dua lapisan peptidoglikan sehingga memiliki permeabilitas dinding sel yang lebih besar. Pewarnaan Gram terdiri atas Gram A (violet) (Kristal violet, Alkohol, Ammonium oksalat, Aquades), Gram B (cokelat) (Iodium, Kalium iodide, Aquades), Gram C (Aseton, Alcohol), Gram D (merah) (Safranin, Alcohol, Aquades) (Madigan, 2003).

Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut: pewarnaan sederhana, pewarnaan differensial (pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam), pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel, pewarnaan spora, pewarnaan kapsul, pewarnaan khusus untuk melihat komponen lain dan bakteri (pewarnaan Neisser (granula volutin), pewarnaan yodium (granula glikogen) dan  pewarnaan negatif  (Rudi 2010).

METODOLOGI

Praktikum tentang pewarnaan gram ini telah dilaksanakan pada hari Jum’at tanggal 29 september 2017 pada pukul 08.00 – 10.00 WIB. Bertempat di Laboratorium Teknologi Hasil Perairan (THP) Jurusan Perikananm, Fakultas Pertanian, Universitas Sultan Ageng Tirtayasa.

            Alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah jarum ose, kaca preparat, pipet tetes, mikroskop, lap, kamera sedangkan bahan yang digunakan adalah akuades steril, alcohol, larutan iodine, larutan safranin, larutan Kristal violet.

            Pada praktikum kali ini prosedur kerja dimulai dengan mensterilkan alat dan bahan yang akan digunakan dalam praktikum mikrobiologi serta praktikum yang akan melakukan percobaan kemudian ambil preparat yang akan dilakukan pewarnaan gram dari kaca penyebar menggunakan jarum ose dan oleskan secukupnya, kemudian teteskan larutan Kristal violet 10 tetes pada olesan bakteri dan diamkan selama 1 menit, cuci dengan menggunakan air mengalir dan keringkan menggunakan tissue secara hati-hati, langkah selanjutnya adalah teteskan dengan larutan iodine 10 tetes tunggu 1 menit kemudian cuci dengan air mengalir dan keringkan menggunakan tissue secara perlahan, langkah selanjutnya adalah teteskan dengan alcohol 10 tetes tunggu hingga 30 detik kemudian cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali menggunakan tissue secara perlahan, langkah terakhir dengan meneteskan larutan safranin tunggu selama 30 detik kemudian cuci kembali menggunakan air mengalir dan keringkan, setelah kering amati keadaan preparat dengan mengidentifikasi warna yang terkandung didalamnya.

Sterilisasi alat dan bahan serta praktikan dengan alkohol

Ambil preparat didalam kaca penyebar menggunakan jarum ose dan oleskan kedalam kaca preparat

teteskan larutan Kristal violet 10 tetes pada olesan bakteri dan diamkan selama 1 menit, cuci dengan menggunakan air mengalir dan keringkan menggunakan tissue

teteskan dengan larutan iodine 10 tetes tunggu 1 menit kemudian cuci dengan air mengalir dan keringkan menggunakan tissue

adalah teteskan dengan alcohol 10 tetes tunggu hingga 30 detik kemudian cuci dengan air mengalir dan keringkan kembali menggunakan tissue secara perlahan

meneteskan larutan safranin tunggu selama 30 detik kemudian cuci kembali menggunakan air mengalir dan keringkan

setelah kering amati keadaan preparat dengan mengidentifikasi warna yang terkandung didalamnya

Gambar 1. Diagram alir Pewarnaan Gram.

HASIL DAN PEMBAHASAN

            Hasil yang didapat dalam praktikum kali ini adalah dalam bentuk olahan data yang dimasukan kedalam tabel sebagai berikut :

Tabel 1. Data hasil pengamatan bakteri pewarnaan gram

Kelompok	Gambar Bakteri	Gram Bakteri
1 (A)		Gram Negatif (-)
1 (B)		Gram Negatif (-)
2 (A)		Gram Negatif (-)
2 (B)		Gram Positif(+)
3 (A)		Gram Negatif (-)
3 (B)		Gram Negatif (-)
4 (A)		Gram Negatif (-)
4 (B)		Gram Negatif (-)

Dalam praktikum ke 5 tentang pewarnaan gram yang dilakukan kelompok 1 mendapatkan hasil gram negatif yang menandakan bakteri terkandung dalam preparat yang diambil dari kaca penyebar adalah bakteri gram negatif, pada tahap awal untuk mendapatkan bakteri tersebut adalah dengan mengikuti langkah kerja yang telah dijelaskan dari awal praktikum.

            Pada bakteri yang telah diberi pewarnaan gram menunjukan warna merah muda, hal ini dikarenakan dinding sel peptidoglican tipis sehingga sangat mudah luntur bila dicuci dengan alcohol. Hal ini berbanding terbalik dengan gram positif. Pada gram positif lipid umumnya tidak larut dalam alcohol dan diduga tidak dapat membesarkan pori-pori dinding sel dan hal itu menyebabkan warna sulit pudar atau luntur. Proses pencucian pada berlangsung lama bila bakteri mengandung gram positif.

            Tetapi pada kelompok lain terdapat gram negative dan gram positif di bakteri yang sama, mungkin di praktikum kelompok kami terlalu kering menggunakan tissue pada saat proses pengeringan dan bakteri gram positifnya menjadi hilang.

KESIMPULAN DAN SARAN

            Dalam praktikum kali ini praktikan telah dapat mengenal alat dan bahan yang digunakan dalam pewarnaan gram mulai dari larutan Kristal violet, larutan iodine, larutan alcohol, larutan safranin serta praktikan dapat mempelajari prosedur dari pewarnaan gram tersebut serta takaran-takaran dalam larutan dalam yang digunakan dalam pewarnaan gram. Dan kini praktikan memahami pentingnya setiap langkah yang dilakukan dalam pewarnaan gram, dan bila itu tidak dapat dilakukan dengan benar maka pewarnaan gram yang dilakukan akan mengalami kegagalan.

            Saran dalam praktikum kali ini adalah praktikan diusahakan lebih dapat memperhatikan kekondusifan dalam praktikum dan lebih dijelaskan secara detail langkah-langkah yang akan dilakukan dalam praktikum selanjutnya agar praktikan lebih memahami apa yang akan disampaikan dan dicatat yang di sampaikan aslab dan untuk mengumpulkan hasil praktikum praktikan yang mengulur ulur waktu sampai larut malam jum’at agar membuat laporannya lebih mudah.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya, Mushoffa. 2010. Teknik Pewarnaan Bakteri. Penebar Swadaya. Jakarta

Cappuccino,J.,G.,&Natalie.,S,1983. Microbiology A Laboratory Manual, Addison Wesley Publishing Company : New York.

Dwidjoseputro. 1994. Mikrobiologi untuk Universitas. Ganesha Expect: Bandung.

Dwidjoseputro, D. 1998. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Jakarta

Entjang. 2003. Kandungan Pegunaan zat warna. Penebar Swadaya. Jakarta

Fitria, Bayu. 2009. Pewarnaan Gram (Gram Positif dan Gram Negatif). PT            Gramedia : Jakarta

Lay, B.W, 1994, Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo        Persada : Jakarta.

Madigan, M.T, 2003, Brock Biology of Microorganism. Pearson      Education : inc. United

Pelczar, M. J., Chan, E.C.S, 2007, Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book

Razali, U., 1987, Mikrobiologi Dasar. FMIPA UNPAD : Jatinangor

Rudi, 2010. Bakteri Gram dan Pewarnaannya. Wordpress : Makassar.

Suriawiria, U. 1999. Mikrobiologi. Universitas Terbuka: Jakarta

Volk & Wheeler, 1993, Mikrobiologi Dasar. Penerbit Erlangga : Jakarta

Waluyo, L. 2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press: Malang